抗體藥物的發(fā)展歷程
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引言
抗體藥物是生物技術制藥領域的一個重要方面�？贵w具有識別抗原的特異性，因而利用抗體診斷與治療疾病是醫(yī)藥研究者長期以來追求的目標�？贵w與靶抗原結合具有高特異性、有效性和安全性，臨床用于惡性腫瘤、自身免疫病等各種重大疾病�？贵w藥物的發(fā)展并不是一蹴而就的，抗體的發(fā)現以及抗體藥物的臨床應用經歷了一段漫長的歷史進程。
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一、免疫實踐的起源
抗體治療的最早應用可以追溯到中國人接種“人痘”預防天花的記載算起，國際上一般公認的人痘接種術最早起源于中國公元１０世紀，但據中國的一些史書記載，種痘始于唐朝。只不過當時種痘只是在民間秘密流傳，沒有公布于世。
隨后，中國人痘接種法傳入日本、俄羅斯、土耳其，并經由土耳其進一步傳入歐洲。在康熙執(zhí)政后，隨著因得過天花而繼承皇位的他開始推廣人痘接種，這一技術逐漸從民間走向皇宮，得到了全國的提倡與推廣。這種技術的傳播對世界范圍內的天花防治產生了重要影響。
到后來的英國人愛德華·琴納受到中國人痘接種法的啟示，接種牛痘預防天花，琴納的牛痘接種法因其安全性逐步取代人痘接種，成為現代醫(yī)學的重要里程碑。
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二、抗體科學概念的萌芽
早在19世紀末，抗體被動免疫療法的創(chuàng)立為當時不發(fā)達的疾病治療開辟了新途徑。Ehrlich提出的側鏈學說為免疫學與免疫療法奠定了基礎。他認為，細胞的表面具有特異性受體分子（或稱側鏈），這些側鏈僅與毒素分子中特定的基團結合；如果細胞與毒素結合后能存活下來，將會產生過量的側鏈，部分的側鏈釋放至血液中，即為抗毒素，這就是現在所稱的抗體。
1890年，德國生理學家 Emil von Behring 與日本微生物學家 Shibasaburo Kitasato 在研究中發(fā)現，暴露于白喉或破傷風毒素的動物血清中存在一種能中和毒素的物質（即抗體前身），將其命名為 “抗毒素”（antitoxin）。他們通過將免疫動物的血清輸注給患病動物，成功治愈感染，首次證明了血清中活性物質的保護作用 。
Emil von Behring 與 Shibasaburo
1891年10月，Ehrlich在論文《免疫力的試驗性研究》中首次使用德語詞 “Antikörper”（抗體），并提出化學結構理論：抗體與抗原的結合遵循 “鎖鑰模型”（類似酶與底物），強調結構互補性是特異性結合的關鍵 。
Ehrlich
到現在，科學家們對于抗體有了一個公認的定義�？贵w是一種由B細胞識別抗原后活化、增殖分化為漿細胞，并由漿細胞合成與分泌的、具有特殊氨基酸序列的，能夠與相應的抗原發(fā)生特異性結合的免疫球蛋白分子。
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三、抗體理論構建階段
在抗體發(fā)現早期，這種特異性的抗體物質勾起了科學家們極大的興趣，科學家們前赴后繼致力于解析抗體的結構，但由于落后的實驗條件，進展緩慢。直到20世紀5O年代，科學家們對抗體的結構和抗原抗體識別機理的理解還非常淺顯。
1937年瑞典物理學家Arne Wilhelm Kaurin Tiselius通過電泳技術證明了抗體也是一種蛋白質，并將其稱為γ球蛋白。1953年英國生物化學家Frederick Sanger成功解析了同樣身為蛋白質的胰島素的化學結構，從而為科學家們解析抗體結構指明了方向。
Arne Wilhelm Kaurin Tiselius
抗體結構的解析離不開美國生物學家Gerald Maurice Edelman，他受到Sanger解析胰島素結構的啟發(fā)，用B-巰基乙醇處理免疫球蛋白G，分解成兩條鏈，根據分子量大小分別稱為重鏈和輕鏈，并在此基礎上提出了自己心目中的抗體結構：重鏈和輕鏈折疊形成奇特的袋狀結構，從而識別抗原。
Gerald Maurice Edelman
1963年，Edelman與RodneyRobert Porter(Sanger的第一個博士研究生)結合兩人多年的研究結果，提出了比較成熟的抗體分子模型。他們認為，抗體是由兩條重鏈和兩條輕鏈組成的“Y”型對稱結構，一條輕鏈和一條重鏈的一半組成了“Y”型結構的分支�？贵w識別抗原的特異性結合位點位于“Y”型結構的兩個分支的頂端，輕鏈和重鏈都有一部分包含其中。
1969年，Edelman和Porter完成了一項在當時了不起的成就，他們成功對抗體1300多個氨基酸序列進行了測定，是當時測定氨基酸序列的最大的蛋白質分子。隨后Edelman繼續(xù)深入研究抗體的結構，陸續(xù)提出了越來越精確的抗體分子結構，包括重鏈可變區(qū)、重鏈恒定區(qū)、輕鏈可變區(qū)、輕鏈恒定區(qū)以及抗體內部二硫鍵的位置，同時他認為抗體的差異是由可變區(qū)的差異決定的。
通過對抗體結構的不懈研究，抗體識別抗原的結構基礎得到了有效闡釋，卻仍無法回避抗體多樣性的基本問題。抗體的分子序列并不固定，免疫系統(tǒng)能夠產生不同抗體結合不同的抗原物質。若依據“一個基因編碼一條多肽鏈”的理論，即使人類基因組都無法滿足抗體多樣性編碼的需求。對于這個問題，Edelman和另一位同行Joseph Gaily于1967年提出了一個抗體多樣性產生的最初的設想。他們認為編碼抗體的基因存在染色體重排現象，識別抗原之后數量有限的抗體基因通過不同的組合形式編碼無限種類的抗體分子。
在Edelman提出的抗體多樣性理論的基礎上，1976年，日本科學家利根川進和同事在檢測不產生抗體的胚胎細胞和產生抗體骨髓瘤細胞中抗體輕鏈基因的分布時發(fā)現，胚胎細胞中不同抗體基因距離較遠，而骨髓瘤細胞中抗體基因距離接近，這個發(fā)現說明生殖細胞在發(fā)育成免疫細胞的過程中，抗體基因發(fā)生了重新分布現象。利根川進在此基礎上用一系列確鑿的實驗數據確定了抗體多樣性是由B淋巴細胞中抗體基岡的染色體重排和突變造成的。根據估算，抗體基因通過重組和突變甚至可以編碼100億種不同的抗體，很好解釋了抗體多樣性產生的原因。1987年，利根川進由于抗體多樣性的突破性研究獨享了該年度的諾貝爾生理學或醫(yī)學獎。
利根川進
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四、治療性抗體的蓬勃發(fā)展
自1986年第一個治療性抗體進入臨床以來，治療性抗體得到了迅速的發(fā)展，其已成為現代生物醫(yī)藥的重要組成部分。到目前為止，全球已獲批的抗體藥物多達196種, 這些抗體都至少獲得一個監(jiān)管機構的批準。伴隨現代科技的發(fā)展，治療性抗體經歷了鼠源性抗體，嵌合抗體，改性抗體和表面重塑抗體（部分人源化抗體），以及全人源化抗體等不同發(fā)展階段。
第一代：鼠源單抗（momab）
第一個單克隆抗體藥Orthoclone OKT3來自于小鼠，它的氨基酸序列都是鼠源的。鼠源抗體在給病人服用過程中常常遇到一些問題：1）人體把這些單抗藥當作異體蛋白，會產生免疫排斥。2）免疫排斥使單抗藥很快從病人體內被清除掉，大大降低了它們應有的療效。尤其治療慢性疾病需要長期服用的情況下，鼠源單抗藥在后續(xù)注射時療效甚微；3）少數病例中，鼠源抗體會引起嚴重的過敏反應，甚至導致了個別病人的死亡。因此，早期單抗藥的銷售始終沒有騰飛——Orthoclone OKT3的年銷售額僅有1千萬美元左右。因此，要想在醫(yī)學上有更廣泛的應用，鼠源抗體必須要轉變成人源化抗體或人源抗體。
第二代：人鼠嵌合單抗（ximab）和人源化單抗（zumab）
人源化抗體一般是以鼠源抗體為基礎，通過更換蛋白片斷和置換部分氨基酸序列， 使抗體的最終氨基酸序列更接近人源的，其最終目的是既不引起人的免疫排斥，又不降低它對靶抗原的親和性。
抗體人源化又分為兩個層次。第一個層次是嵌合抗體（Chimeric antibody）: 抗體的恒定區(qū)都被置換成人的氨基酸序列。嵌合單抗蛋白約33%的氨基酸序列來自小鼠，其余67%為人源的。第二個層次是人源化抗體(Humanized antibody)，即拿到針對某抗原的小鼠抗體后，只取其識別抗原的幾段區(qū)域（CDR區(qū)域），把它們移植到人源抗體中。人源化單抗中人源的序列占90%。人源化單抗顯然比嵌合單抗更有優(yōu)勢，引起免疫排斥或超敏的風險更低。但即使這樣，由于鼠源序列的存在，人源化單抗還是不能完全避免免疫排斥或超敏的風險。
第三代：全人源化單抗（mumab）
獲得全人源單抗主要有兩種途徑：噬菌體展示和轉基因小鼠。
噬菌體展示和轉基因小鼠在執(zhí)行過程中各有千秋。一般來說，噬菌體展示技術“先快后慢”，即找到針對某種靶蛋白的抗體很快，但選出的這個抗體和靶蛋白的親和性往往不高，需要人工細調，更換個別氨基酸。優(yōu)化這一步費時費力，而且即使優(yōu)化的抗體和通過轉基因小鼠出來的抗體相比，親和力可能還是相差一個數量級。另外，在優(yōu)化的過程中需要替換一些氨基酸，也就引進了被免疫排斥的風險。
轉基因小鼠技術是“先慢后快”，將抗原注射到小鼠體內、產生特異抗體、制備雜交瘤細胞等前幾步需要幾個月的時間。但一旦最初的抗體產生，其優(yōu)化過程在小鼠體內繼續(xù)完成，又快又好，并且不用擔心免疫排斥的問題。
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五、抗體的篩選技術
近年來，隨著抗體藥的需求越來越大，抗體篩選技術的發(fā)展也是日新月異，目前應用較普遍的有雜交瘤技術、抗體文庫篩選技術、B細胞克隆技術和轉基因小鼠抗體篩選技術。
雜交瘤技術
雜交瘤技術又稱為單克隆抗體技術，是在體細胞融合的技術基礎上發(fā)展而來的。這項技術將免疫動物的B淋巴細胞與骨髓瘤細胞融合，即可形成在體外長期存活并分泌免疫蛋白的雜交瘤細胞，通過克隆化可得到來自單個雜交瘤細胞的單克隆系，即雜交瘤細胞系，利用雜交瘤細胞可以大量的生產單克隆抗體。
細胞融合技術是雜交瘤技術的基礎，通過聚乙二醇（PEG）（最常用）、仙臺病毒、電轉等方法對細胞進行人工誘導，可使兩個細胞通過膜融合形成單個細胞。融合細胞的篩選 HAT培養(yǎng)基篩選技術是雜交瘤技術中另一個關鍵的技術，在B淋巴細胞與骨髓瘤細胞融合后，會產生多種融合結果（未融合的骨髓瘤細胞、未融合的B淋巴細胞、B淋巴細胞自身融合細胞、骨髓瘤細胞自身融合細胞、正確融合的雜交瘤細胞），為了得到所需的雜交瘤細胞，必須利用 HAT 培養(yǎng)基對融合后的細胞進行篩選。
HAT培養(yǎng)基的篩選原理為：DNA合成途徑有生物合成途徑與應急合成途徑兩種，HAT培養(yǎng)基中含有次黃嘌呤（H）、氨基喋呤（A）和胸腺嘧啶核苷酸（T）等物質，氨基喋呤可以對 DNA的生物合成途徑進行阻斷，骨髓瘤細胞會因為生物合成途徑被阻斷且自身缺乏應急合成途徑導致不能增殖進而快速的死亡；而B淋巴細胞因缺乏體外增殖的能力，一般在10天左右死亡；雜交瘤細胞具有體外增殖能力且由于次黃嘌呤與胸腺嘧啶核苷酸的存在，可以通過應急途徑合成DNA并在 HAT培養(yǎng)基中正常生長，不會死亡。因此將融合后的細胞放于 HAT 培養(yǎng)基中培養(yǎng)，其他的融合結果會全部死亡，最終篩選出雜交瘤細胞。
噬菌體展示技術
1985年Smith GP利用基因工程，將外源基因插入絲狀噬菌體(Filamentous bacteriophage，fd)的基因組，使目的基因編碼的多肽以融合蛋白的形式展示，從而創(chuàng)建了噬菌體展示技術。
噬菌體展示技術（phage display）是將外源編碼多肽或蛋白質的基因通過基因工程技術插入到噬菌體外殼蛋白結構基因的適當位置，在閱讀框能正確表達，使外源多肽或蛋白在噬菌體的衣殼蛋白上形成融合蛋白，隨子代噬菌體的重新組裝呈現在噬菌體表面，可以保持相對的空間結構和生物活性。然后利用靶分子，采用合適的淘洗方法，洗去未特異性結合的噬菌體。再用酸堿或者競爭的分子洗脫下結合的噬菌體，中和后的噬菌體感染大腸桿菌擴增，經過3-5輪的富集，逐步提高可以特異性識別靶分子的噬菌體比例，最終獲得識別靶分子的多肽或者蛋白。除了噬菌體展示技術之外，基于文庫展示的技術還包括：酵母展示技術、核糖體展示技術以及細胞展示技術等。
B細胞克隆技術
人和動物接受了外源性免疫原（如細菌、病毒、非同源蛋白等）的刺激后，獲得性免疫（Adaptive Immunity）被激活，并在 T 淋巴細胞、巨噬細胞和樹突狀細胞等免疫細胞的協(xié)同作用下，由 B 淋巴細胞產生針對于該病原體（或免疫原）的抗體分子；B 淋巴細胞經過一系列的成熟和分化之后，最終形成漿細胞（Plasma cell）將大量的 IgG 分泌到血液等循環(huán)系統(tǒng)中；而特定的某一個 B 淋巴細胞在經歷了 V-D-J 重排、Class Switch 和 Somatic maturation 之后，只含有一對編碼 IgG 重鏈和輕鏈的基因。
因此，經過 B 淋巴細胞表面標記物和抗原特異性篩選，可以獲得針對特異性抗原的單個 B 淋巴細胞，然后通過分子生物學手段從中獲得編碼抗體 IgG 的重鏈和輕鏈基因，并在體外重組表達驗證，是目前獲得單克隆抗體最有效和快速的技術。
基于單 B 細胞篩選的抗體發(fā)現技術發(fā)展，還得益于流式細胞技術、微流控技術（Microfluidic）以及光流體技術（Optofluidic）等相關生物技術的發(fā)展和成熟，使其成功的從實驗室走向商業(yè)化應用，并在單克隆抗體特別是治療性單克隆抗體的開發(fā)方面被廣泛應用。
基于單 B 細胞分選技術的單克隆抗體開發(fā)平臺，和傳統(tǒng)的單克隆抗體開發(fā)平臺相比，最突出的優(yōu)勢在于能夠從人體內直接篩選獲得全人源單克隆抗體；同時，也能夠大大縮短研發(fā)周期，從獲得康復病人的外周血淋巴細胞開始，一般來說在 4-6 周內即可獲得全人源單克隆抗體，并完成相應的生物學功能實驗（如病毒結合和中和實驗、ADCC 實驗等）；并且由于所獲得是全人源單克隆抗體，可以大大簡化甚至于不需要抗體人源化改造工程，快速推進至臨床試驗�！ �
轉基因小鼠全人源抗體篩選技術
早在1985年，Alt等人就曾提出可以應用轉基因技術得到具有人源序列的單克隆抗體。1989年，Bruggemann等人在小鼠中表達了人源重鏈，從而產生了轉基因編碼的免疫應答。而在1994年，Lonberg和Jakobovits的團隊分別采用了不同的方法構建了能夠表達人源抗體的轉基因小鼠。Lonberg利用了核內顯微注射的方法，而Jakovovits用的是酵母人工染色體（YAC）的方法。重鏈包含3個重鏈可變區(qū)（VH），16個D，所有的6個JH區(qū)。
Abgenix的XenoMouse®是第一個同時有大部分人源VH和人源Vκ repertoire的轉基因小鼠品系。這些XenoMouse®小鼠有百萬堿基對大小的酵母人工染色體，在重鏈基因座，有34個有功能的VH基因，全部的DH和JH區(qū)域，作為Cμ和Cδ功能下游的人源Cγ2基因；κ輕鏈基因座含有18個Vκ基因，全部五個功能性的Jκ區(qū)，和Cκ基因。由于YAC可以整合到小鼠染色體中，這樣得到的小鼠具有較好的基因穩(wěn)定性。2005年，安進以22億美元收購Abgenix。XenoMouse平臺上開發(fā)出的第一個單抗藥物是Abgenix和安進共同開發(fā)的抗EGFR單抗panitumumab（于2006.9被FDA批準），這也是基于轉基因小鼠的第一個全人源單抗藥物。
另一個用于產生全人源抗體的小鼠是GenPharm International, Inc開發(fā)的HuMab™或者叫Ultimab®。1997年，Medarex收購了該公司獲得這一技術平臺。2009年，BMS以24億美元收購Medarex，將Humab小鼠收入囊中。這一平臺可產生高親和力（納摩到亞納摩級別）的人源抗體。Ofatumumab是基于Ultimab平臺開發(fā)出的抗CD20單抗，它和同為CD20抗體的rituximab靶向的表位不同。Ofatumumab于2009年十月被FDA批準用于治療慢性淋巴細胞白血病。Ultimab平臺還有一系列諸如Canakinumab（抗interleukin-1β的IgG1單抗，用于治療一種罕見的自身炎癥性疾病Cryopyrin蛋白相關周期性綜合征）, Ustekinumab（靶向IL-12和IL-23所共有的p40亞單位，用于18歲及以上活動性銀屑病關節(jié)炎患者的治療）等單抗產生。
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結語
抗體藥物從發(fā)現到進入臨床應用，經歷了曲折而又漫長的歷程。在這段時間里，人們對于抗體藥物的認識發(fā)生了巨大的變化。在過去的數十年里，抗體已經成為醫(yī)藥市場上最暢銷的藥物。隨著抗體類藥物被批準用于治療各種包括癌癥、自身免疫、代謝和傳染病，治療性抗體藥物的市場必會呈現爆炸式增長的態(tài)勢。
原文標題 : 抗體藥物的發(fā)展歷程
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